生合成プロセスの時間的分離は、出芽酵母の細胞周期中の代謝振動の原因となります

Oct 18, 2023

Nature Metabolism volume 5、pages 294–313 (2023)この記事を引用

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真核生物の細胞分裂の基本的なプロセスを制御する多くの細胞生物学的および生化学的メカニズムが特定されています。しかし、細胞分裂周期中の生合成プロセスの時間的動態はまだ解明されていません。今回、我々は、重要な生合成プロセスが細胞周期に沿って時間的に分離されていることを示す。出芽酵母をモデルとして使用し、単細胞法を使用して代謝活性を動的に測定すると、タンパク質合成のピークが G1 期と S/G2/M 期に 2 つあるのに対し、脂質と多糖類の合成ピークは S/G2 期に 1 回だけ観察されます。 /Mフェーズ。推定された生合成速度を熱力学的化学量論的代謝モデルに統合すると、生合成プロセスにおけるこの時間的分離が、G1 におけるグルコース取り込みフラックスの加速と、酸素と二酸化炭素の交換の位相シフト振動を伴い、一次代謝におけるフラックス変化を引き起こすことがわかります。。モデル予測の実験的検証を通じて、細胞周期中に予期せぬ動態を示す生合成プロセスの変化する要求を満たすために、一次代謝が細胞周期の周期性で振動することを実証します。

細胞の成長と分裂は基本的な生物学的プロセスです。私たちは、細胞分裂周期を制御する細胞の生物学的および生化学的メカニズムについて確かな説明を持っていますが、細胞周期中の細胞成長を促進する生合成と一次代謝の時間的動態についてはほとんどわかっていません。 DNA 生合成は S 期内に一時的に制限されることが知られていますが、タンパク質や脂質の合成など、他の主要な生合成プロセスの動態は不明のままです。生合成プロセスは細胞周期全体を通じて常にアクティブですか? それらの活性が変化すると、さまざまな生合成プロセスの速度も同じように変化するのでしょうか? このような知識は、細胞増殖制御の背後にあるメカニズムを明らかにするために不可欠であり、その欠陥が疾患に関連しています1,2。

現在、タンパク質合成は、放射性標識を用いた集団レベルの研究 3,4,5 および単一細胞分析 6,7 によって決定されるように、酵母の細胞周期を通じて指数関数的または一定の速度で増加すると考えられています。しかし最近、内在性TEF1プロモーターによって制御される緑色蛍光タンパク質（GFP）の生成速度がG1でピークに達することを発見し（参考文献8）、タンパク質生合成活性が実際には細胞周期中に非単調である可能性があることを示唆している。この発見は、G1 で観察されたリボソームタンパク質存在量のピークと一致すると考えられますが (参考文献 9)、他の研究者はそのような動態を発見していません 10。同様に、リボソームの生合成と翻訳に関連する遺伝子の発現も、G1 でピークに達することが観察されています (参考文献 10、11)。しかし、単一細胞 RNA シーケンス (RNA-seq) 研究では、G1 におけるリボソームタンパク質 mRNA のわずかな増加のみが報告されているか (参考文献 12)、細胞周期全体にわたって顕著な差異は報告されていません 13。脂質や核酸などの他の高分子クラスについても、最近のマルチオミック研究によれば、その生合成が細胞周期の特定の段階で加速することが示唆されています9、10。しかし、これらの研究で測定された分子存在量は、実際の生合成速度に関する間接的な証拠しか提供しません。したがって、細胞周期中の生合成活動の時間的動態は依然としてほとんど解明されていません。この疑問に答えるには、細胞周期を分解した動的な方法で速度を測定する必要があると思われますが、これには今のところ大きな技術的課題が生じています。

今回、出芽酵母をモデルとして使用し、新しいストップアンドレスポンス法を備えた動的単一細胞蛍光顕微鏡法を採用することで、タンパク質、脂質、多糖類の生合成活性が細胞周期中に指数関数的でも一定でもないことを発見しました。具体的には、タンパク質生合成は細胞周期ごとに2つの活性の波を示すのに対し、脂質と多糖類の生合成の活性はG1のタンパク質生合成の第1波では低く、S/G2/Mの第2波では高くなることがわかりました。私たちは、発見された生合成活性のパターンを細胞質量動態の数学的モデルを介して絶対単位に変換し、それらを熱力学化学量論的代謝モデルに統合し、それによって一次代謝フラックスの細胞周期動態を推測しました。推定された代謝フラックスの変化を実験的に検証することができたので、発見された生合成活性の動的パターンに対する追加の証拠が得られ、生合成プロセスにおける時間的分離が一次代謝における時間スケールの振動の原因であるに違いないと結論付けることもできました。。私たちの研究は、細胞周期中の細胞の成長が、時間的に分離された生合成プロセスと一次代謝プロセスの集合体であることを示しており、これは細胞生理学のまさに基本に対する基本的な洞察を提供します。

threefold change) and respective cell growth rates (>11-fold change), which are larger spreads than those during the cell cycle (~1.4-fold change of dry mass and ~1.6-fold change of dry mass derivative, as estimated from our data). The changes in protein synthesis rate during the cell cycle that we report here could thus be well hidden in the noise of the cell mass/growth rate data from the other work57. Moreover, cellular composition changes during the cell cycle could potentially confound a direct comparison of the buoyant-mass data57 with our dry-mass-related data (as shown in formula 1 in recent work58). The authors of the paper57 have cautiously not made any conclusion on cell-cycle dynamics of cell growth rate in yeast./p> \Delta \bar t_{\mathrm{START}} \cap E^c = {\mathrm{ME}}\), \(\varphi ^c > \Delta \bar t_{\mathrm{BUD}} \cap E^c = {\mathrm{START}}\) or \(\varphi ^c > \Delta \bar t_{CC} \cap E^c = {\mathrm{BUD}}\). Therefore, we arrived to a smaller or the same set of cells \(S2,\left| {S2} \right| \le \left| {S1} \right|,\) for which we associated the NAD(P)H derivative value Pc with the position in cell cycle φc when perturbation happened. Besides, for each cell \(c \in S2\), we stored the information about the kind of the cell-cycle event closest to perturbation, Ec./p> \overline {F_i} \left( {15 \times 15} \right) + p30\), where Fi is the pixel’s intensity, \(\overline {F_i} \left( {15 \times 15} \right)\) – the mean intensity among the nearest 15 × 15 pixels (roughly, a third of the mother cell) and p30 – the thirtieth percentile among the mother cell’s pixels (Python’s method skimage.filters.threshold_local with block_size = 15, method = ‘mean’, offset = p30 and mode = ‘nearest’). Using the offset p30 helps to discard a small number of cytoplasmic pixels that due to noise happen to be brighter than their neighbors. For the same purpose, after the local thresholding, we removed objects (ensembles of selected pixels) smaller than 25 pixels and having the connectivity equal to 1 (two pixels are connected by one orthogonal step). Eventually, we segmented one object containing the brightest pixels, which represents nucleus. If some pixels inside this object were not selected in the local thresholding (due to noise, some single pixels may be dimmer), then we added these pixels to the selection. To calculate the abundance of the fusion Hta2-mRFP in the mother-cell nucleus, we summed the intensities of the pixels located within the segmented nucleus. Microscopy image processing was performed in Python with the help of the module skimage./p> 0\), where Sij is the coefficient of j = ATP in the reaction i that has the flux \(v_i^{\mathrm{cell}}\left( t \right)\) (mol cell−1 h−1) (due to the steady-state assumption of FBA, the turnover values would be the same if ATP-depletion fluxes only were summed). We showed individual reactions i whose cytoplasmic flux of j = ATP calculated as \(S_{ij}\,v_i^{\mathrm{cell}}\left( t \right)\) is bigger than 0.09 or smaller than −0.09 (mol cell−1 h−1) in at least one cell-cycle phase. In Fig. 4d, for each precursor, we calculated the sum of its fluxes, \(\mathop {\sum}\nolimits_i {S_{ij}v_i^{\mathrm{cell}}(t)}\), in the reactions diverting from central metabolic pathways to the synthesis of major biomass components: for ribose 5-phosphate (r5p), its fluxes in the syntheses of AMP, GMP and UMP as well as phosphoribosyl pyrophosphate; for erythrose 4-phosphate (e4p), its flux in the synthesis of 3-deoxy-d-arabino-heptulosonate 7-phosphate; for phosphoenolpyruvate (pep), its fluxes in the reactions of 3-deoxy-d-arabino-heptulosonate 7-phosphate synthetase and 3-phosphoshikimate 1-carboxyvinyltransferase; for pyruvate (pyr), the l-alanine flux in the reaction of protein biosynthesis; for acetyl-CoA (accoa), its fluxes in the reactions of zymosterol synthesis, homoserine O-trans-acetylase, 2-isopropylmalate synthase and lipid biosynthesis; for glycerol 3-phosphate (g3p), its flux in lipid biosynthesis; for glucose 6-phosphate (g6p), its fluxes in polysaccharide and lipid biosynthesis; for fructose 6-phosphate (f6p), its flux in polysaccharide biosynthesis./p>

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